Už ką Nobelio premijos negavo Virginijus Šikšnys
Genomo redaktorius

Bet kurį genomą galima palyginti su tekstu: arba dar vaizdingiau, su knyga – yra storesnių ir plonesnių knygų; yra sudėtingesnių ir paprastesnių. Knygoje raidės sujungtos į žodžius. „Plytas“, iš kurių sudaryta DNR, vadina genetinėmis raidėmis: A (adeninas), T (timinas), G (guaninas) ir C (citozinas). Jos irgi susidėlioja į „žodžius“ – jungdamosios po tris jos koduoja amino rūgštis. O „žodžiai“-trejetai sudaro sakinius – dideles baltymų molekules sudarytas iš daugelio amino rūgščių.

Kaip ir tekste, genome irgi pasitaiko klaidų, vadinamų mutacijomis. Dauguma mutacijų jokios įtakos nedaro, tačiau pasitaiko žalingų mutacijų. Klaidas tekste taiso korektoriai ir redaktoriai. Gyvos ląstelės turi savo korektorius ir redaktorius, taisančius DNR defektus – specialūs fermentai, įeinantys į vadinamąsias reparacijos sistemas (už DNR reparuojančių sistemų iššifravimą 2015 m. skyrė Nobelio premiją), tačiau jie ne visada ištaiso tai, ką reikia ištaisyti. Tai ar nereiktų sukurti molekulinį redaktorių, ištaisantį nepageidaujamas mutacijas?

CRISPR-Cas9 – būtent toks redaktorius. Tačiau tai nėra vienintelis genomo redagavimo būdas – DNR teksto perrašymo idėja kilusi senai ir vystantis molekulinei biologijai pradėjo atsirasti atitinkamos eksperimentinės technikos. Tačiau genomo redagavimo priemonė turi būti tiksli, universali ir patogi. Tikslus metodas darys pakeitimus tik ten, kur reikia, be jokios savivalės. Universalus – darys pakeitimus bet kurioje chromosomos vietoje. Vertinant CRISPR-Cas9 – neabsoliučiai tikslus, ne visai universalus, nepakankamai patogus. Pavadinimas išsišifruoja kaip „Trumpi palindrominiai pakartojimai reguliariai išsidėstę grupėmis“ (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), o Cas9 - CRISPR asociuotas baltymas 9. Bet kas tie pakartojimai, kur tos grupės ir kodėl su jais susieti kažkokie baltymai?

Biologai tai sugalvojo ne nuo nulio, o nusižiūrėjo nuo bakterijų ir archėjų, kur tai yra sistema apsigynimui nuo virusų. 20 a. 9-me dešimtm. žarnyno lazdelės ir kitų mikrobų DNR‘e aptiko keistas struktūras: palindrominių sričių, tarp kurių yra kažkokios kitos genetinės sekos, grupes. Palindromais vadina nukleotidų sekas, kurios vienodai „skaitomos“ (pvz., kaip žodis „savas“). Tas palindromines sekas pavadino CRISPR. Tačiau įdomiausia buvo tai, kas radosi tarp palindromų – virusinių sekų fragmentai!

Kai bakteriofagas (bakterinis virusas) užpuola bakteriją, jis į ją įšvirkščia savo nukleininę rūgštį ir pradeda daugintis. Bakterija arba žūsta, arba atsikrato viruso ir išgyvena. Išgyvenusios bakterijos viruso DNR (arba RNR) fragmentą išsaugo savo genome, CRISPR segmentuose. Taigi, vaizdžiai kalbant, CRISPR – kartoteka apie virusų atakas. Kai ląstelėje vėl pasirodo svetima DNR, bakterija ją patikrina kartotekoje ir, suradosi sutapimą, greitai sunaikins, nesuteikusi virusui šansų. Net trumpų virusinių sekų pakanka veiksmingai atpažinti virusą. Pvz., atsivertę atsitiktinėje vietoje knygą ir atverstame puslapyje pamatę Liudo Vasario vardą, galime spėti, kokią knygą atvertėme.

Truputį apmaudu, kad Nobelio premijos komitetas užmerkė akis dėl Virginijaus Šikšnio indėlio į šios srities vystymą. O juk jis 2018 m., kartu su minėtomis E. Šarpantjė ir Dž. Doudna, pasidalino milijoninę prestižinę Kavli premiją (įsteigtą norvegų filantropo F. Kavli ir teikiamą nuo 2008 m.) nanomokslų srityje. Ir tikro apmaudu, kad kertinį straipsnį „Cell“ žurnalui jis pateikė 2012 m. balandį, dviem mėnesiais anksčiau nei E. Šarpantjė ir Dž. Doudna - „Science“. Tačiau „Cell“ jo straipsnį atmetė net nepasiuntusi recenzentams – ir tada po mėnesio jis pasiuntė jį PNAS, kur kelis mėnesius truko jo recenzavimas ir publikavimas. O „Science“ tai padarė per 2 sav. (nors 2018 m. pripažino, V. Šikšnį tai padarius pirmuoju).

Ir dar buvo Feng Zhang’as, kurio komanda viena pirmųjų pritaikė CRISPR genų redagavimą žinduoliams (pelių ir žmogaus ląstelėms). Jo darbdavys bylinėjosi dėl technologinio patento su UC-Berkeley, kuriame dirba Dž. Doudna.

Be to, Šikšnys iš Harvardo un-to gavo ir W. Alpert’o premiją už vadinamųjų „genų žirklių“ sukūrimą.

Su CRISPR-Cas9 V. Šikšnys su komanda dirba nuo 2007-ųjų. Jie sukūrė ir 2015 m. „DuPont Pioneer“ kompanijai licencijavo kryptingai valdomu Cas9 paremtą genomo redagavimo technologiją.

Minėti „kertiniai“ straipsniai:

  • M. Jinek, K. Chylinski, I. Fonfara, M. Hauer, J.A. Doudna, E. Charpentier. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity// Science. 337 (6096), Aug. 2012): 816-821
  • G. Gasiunas, R. Barrangou, P. Horvath, V. Siksnys. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria// Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2012, 109:E2579–2586

Ir aišku, čia neišsiverčiama be baltymų. DNR CRISPR seka pradžioje kopijuojama į vieną didelę RNR, o tada ši supjaustoma į gabalėlius, kurie turi tvirtai susijungti su svetima DNR, t.y. tarp jų nukleotidų turi susidaryti komplementariniai vandeniliniai ryšiai. Jei kai kurie nukleotidai atitiko, o kiti ne – vadinasi tai ne viruso DNR. Tačiau jei RNR gabalėlis tiksliai sukibo, tai reiškia, kad aptiktą nukleininę rūgštį reikia pjauti. Ir visas tas procedūras atlieka Cas9 baltymai.

Dabar tų baltymų yra jau 93, o jų genai yra saugomi bakterijos DNR greta CRISPR kartotekos (iš čia ir santrumpa Cas - CRISPR asocijuoti). Ne visi tie 93 baltymai veikia kartu visose bakterijose ir archėjuose. CRISPR-Cas sistemų yra virš 20 atmainų, besiskiriančių tiek baltymų rinkiniais, tiek veikimo ypatybėmis, tačiau iš esmės visos jos užsiima tuo pačiu: CRISPR kartotekos papildymu, potencialiai pavojingų DNR paieška, virusų sunaikinimu ir pan. Gyvūnų imuninė sistema veikia kitaip (informaciją apie ankstesnes infekcijas saugo specialios imuninės ląstelės), tačiau ir čia yra panašumų: „svetimųjų“ atpažinimas ir sunaikinimas.

Vis tik „bakterinio imuniteto“ hipotezę pavyko pagrįsti tik 2007 m., o po to dar kelis metus bandė iššifruoti molekulinį mechanizmą. Minėta ilga RNR vadinama pre-crRNA (kas reiškia CRISPR-RNA pirmtakę): ji privalo „subręsti“, t.y. suskilti į smulkius gabalėlius, į daugelį crRNA arba CRISPR-RNA.

E. Šarpantjė1) su kolegomis sugebėjo aprašyti, kaip subręsta pre-crRNA. Pasirodė, kad reikalinga kita RNR, užkoduota bakterijos chromosomoje kiek nuošaliau nuo CRISPR-Cas srities. Ji vadinama tracrRNA - trans-encoded, nes ji užkoduota lygiagrečioje DNR. Nedidelė tracrRNA „sėda“ ant ilgos crRNA ten, kur ją reikia perpjauti. Cas baltymai, savo ruožtu, susijungia su suporintomis RNR ir stipriai susikabina. Iš paskos atskuba fermentas, perpjaunantis pre-crRNR ir kažkiek pakerpantis tracrRNA. Gaunamas Cas baltymo ir dviejų RNR - crRNA, kurioje įrašytas viruso fragmentas, ir pagalbinės tracrRNA – derinys.

tracrRNA vaidmuo neapsiriboja pagalba pjaustant ilgąją pre-crRNA. Kartu su Dž. Doudna2) buvo išsiaiškinta, kad jos reikia ir tam, kad Cas9 baltymas galėtų pažnaibyti virusinę DNR. Sužinoti, ar tai virusas, reikalinga crRNA, tačiau, kad fermentas suveiktų ir suardytų virusinį genomą, reikia jos porininkės tracrRNA.

O tada E. Šarpantjė su Dž. Doudna kilo mintis, kas abi tas RNR galima sujungti į vieną molekulę. Gautųsi viena RNR, kuri nuvestų Cas9 baltymą į reikiamą DNR vietą ir kartu priverstų perpjauti tą DNR. Ir tokia hibridinė RNR buvo sukurta – ją pavadino sgRNA (single-guide - vedlys). Kita mintis prašėsi pati savaime: RNR-vedlio seka su DNR sąveikaujančioje dalyje gali būti bet kokia. Taigi galime sintetinti dirbtinai nukreipiančią RNR ir jos pagalba nutaikyti Cas9 į bet kokios DNR bet kurią sritį – augalo ląstelės, pelės, žmogaus DNR.

Štai kaip veikia CRISPR-Cas9 redaktorius. Tarkim, kažkuriame gene atsirado pavojinga mutacija. Jokios CRISPR bibliotekos jau nereikia – mes patys sintetiname RNR, savo seka sutampančią su mutavusiu DNR fragmentu. Toji RNR bus baltymo Cas9 vedliu – mes ją įteikiame baltymui ir pasiunčiame į ląstelę (tam reikalingos priemonės jau turimos). Cas9 suranda mutavusį fragmentą ir pjauna tą DNR (vieną ar abi spirales – tai priklauso nuo metodo modifikacijos). Tačiau perpjauti nereiškia pataisyti. Juk mums reikia išpjauti mutavusią genetinę raidę ir vietojo jos įstatyti teisingą. O Cas9 tik tiesiog pjauna.

DNR taisymu užsiima vadinamosios DNR reparacijos sistemos – sudėtingi baltymų kompleksai, atpažįstantys įvairius DNR defektus. Reparacijos sistemas turi kiekviena ląstelė; ir DNR atsiradus trūkiui, jos atskuba jo susiuvimui. Tačiau ląstelė ne tiesiog susiuva trūkį, - ji pakeičia visą DNR gabalėlį, į kurį įeina ir trūkio vieta, ir kelios dešimtys genetinių raidžių abiejose trūkio pusėse. Vietoje pažeisto fragmento sintezuojamas naujas. Tam reikalingas šablonas su teisinga genetinių raidžių seka. Paprastai reparacijos šablonu panaudoja kitą, nenutrauktą DNR grandinę arba atitinkamą homologinės chromosomos3) sritį. Tačiau įmanoma pateikti ir savą šabloną. Tam kartusu CRISPR-Cas9 į ląstelę siunčiama ir pavyzdinė DNR. Taigi CRISPR-Cas9 reikalinga tam, kad būtų įjungti genomo remonto mechanizmai.

Iki CRISPR-Cas9 buvo ir kitų DNR redagavimo metodą, kurių esmė tokia pati: perpjauti DNR reikiamoje vietoje, kad vėliau tas pjūvis būtų užlopytas reikiamu lopu. Tik CRISPR-Cas9 yra patogesnis, nes kituose metoduose pjūvio vietos ieško baltymas, kuris arba pats pjauna DNR, arba tai daro jo porininkas. Taigi tai buvo baltyminiai redaktoriai. O baltymus suderinti kitai DNR nėra paprasta, nes baltymų molekulės sudėtingos ir ne visad atlaiko tokį įsikišimą.

DNR žirklės Žinoma, ne vien E. Šarpantjė ir Dž. Doudna tyrinėjo CRISPR-Cas9, tačiau būtent jos nurodė jos esmines ypatybes. Jų straipsnis apie tai, kaip galima ją pritaikyti biotechnologiniams poreikiams, pasirodė 2012 m. – ir po to šiai temai skirtų straipsnių skaičius sparčiai gausėja. Atsirado įvairios sistemos modifikacijos, patobulinimai, išbandymai su įvairiais organizmais: mielėmis, drozofilomis, kirminais, ryžiais; pelių, kiailių ir net žmonių ląstelėmis.

1914 m. „Nature Biotechnology“ buvo paskelbtas straipsnis, kuriame aprašoma, kaip pelės buvo išgydytos nuo tirozinemijos, baisios medžiagų apykaitos ligos, kai nustoja funkcionuoti inkstai, kepenys ir nervų sistema. Taip pat yra tyrimų, atstatančių fotoreceptorių žūtį akies tinklainėje nuo apakimo apsaugant gyvūnus linkusius pigmentiniam retinitui (paveldimam degeneratyviniam susirgimui). Ir galiausiai 2019 m. spalį „Nature Communications“ paskelbė straipsnį, kaip CRISPR-Cas9 pagalba pėlėms išnaikintos vėžinės ląstelės neliečiant sveikųjų.

Bet pelės lieka pelėmis, o kaip su žmonėmis?! Na jiems ir pamažiukais pradeda tai taikyti. 2019 m. kompanijos „CRISPR Technologies“ ir „Vertex Pharmaceuticals“ paskelbė išgydę du pacientus su genetiniais kraujo susirgimais: beta- talsemija ir pjautuvinės ląstelės formos anemija. Buvo redaguojami kamieninių ląstelių, iš kurių atsiranda eritrocitai, genai.

Tiesa, kalbant apie CRISPR-Cas9 taikymą „žmonėms“, dažniau prisimenami palyginti neseni skandalai, susiję su embrionų redagavimu. Tam yra prasmė – jei žinoma, kad naujagimiui teks pavojingos mutacijos, kurios vėliau apsunkins jo gyvenimą, tai kodėl „neištaisius“ jo genų pačioje pradžioje, kas gerokai paprasčiau, nei vėliau?! Tačiau čia kyla įvairūs moraliniai-juridiniai klausimai, susiję su embriono subjektyvumo problema. Ji iki šiol sukosi tik mokslo rate, kol 2015 m. kinai žurnale „Protein&Cell“ neaspausdino straipsnio apie Sun Jatseno un-te atliktą žmogaus embrionų genomo redagavimą. O debatai pasiekė piką, kai 2018 m. Kinijoje gimė dvi mergaitės, kurios CRISPR-Cas9 redagavimu tapo atsparios ŽIV (bent taip tvirtina tie tyrinėtojai).

Kita vertus, CRISPR-Cas9 tikslumas nėra absoliutus. Nemažai darbų rodo, kad CRISPR-Cas9 mažai tinka žmogaus genoo redagavimui – per didelė neplanuotų mutacijų rizika. Problema glūdi mūsų genų kintamume – ta pati DNR seka skirtingiems žmonėms gali skirtis viena ar keliomis raidėmis. Tad Cas9 su nukreipiančia RNR gali „prisišlieti“ dešimtyse, o tai ir šimtuose kitų, neplanuotų genomo taškų. Tačiau žmogus turi ir tokių genų, su kuriais CRISPR-Cas9 veikia ypač tiksliai. Tad kol kas metodo pritaikymas žmonėms dar labai ribotas ir, greičiausia, nebus labai greitai taikomas plačiai.


1) Emanuelė Šarpantjė (Emmanuelle Marie Charpentier, g. 1968 m.) - prancūzų mikrobiologė, Nobelio premijos chemijos srityje laureatė (2020). Nuo 2018 m. dirbo Makso Planko patogenų tyrimų centro direktorė. 2011 m. sutikusi Dž. Doudną ėmė bendradarbiauti CRISPR tyrimų srityje. 2012 m. jos abi straipsnyje pasiūlė, kad CRISPR-Cas9 galima užprogramuoti genų redagavimui. 2013 m. buvo viena iš „CRISPR Therapeutics“ steigėjų.

2) Dženiferė Doudna (Jennifer Anne Doudna, g. 1964 m.) - amerikiečių biochemikė ir genetikos specialistė, Nobelio premijos chemijos srityje laureatė (2020). Nuo 7 m. augo Havajuose, kur jautėsi svetima tarp vietinių. Nuo 2002 m. dirba Kalifornijos un-te Berklyje. Darbai daugiausia skirti struktūrinei biologijai ir biochemijai. Į CRISPR 21 a. pradžioje tyrimus ją įtraukė J. Banfield. Dž. Doudną suradusi per „Google“ paiešką. Išleido kartu su bendraautoriais knygą „Įtrūkimas pasaulyje: genomo redagavimas“ (2017). 2017 m. buvo viena „Mammoth Biosciences“ steigėjų. Per epidemiją vadovauja COVID-19 testavimo centrui.

3) Homologinės chromosomos - chromosomų su vienodais genų ir rinkiniais ir tokia pačia struktūra poros. Jose viena ateina iš tėvo, o kita iš motinos; ir vienoje, ir kitoje tie patys genai išsidėstę ta pačia seka, tačiau tų genų variantai gali skirtis. Pvz., beta-globino genas (vieno iš baltymų, įeinančių į hemoglobiną) yra 11-oje chromosomoje, o tiksliau kiekvienoje iš dviejų 11-ų chromosomų, tiek tėvo, tiek motinos. Jei beta-globino genas motinos chromosomoje bus pažeistas, reparuojantys baltymai ištaisys pažeidimus, pavyzdžiu paėmę tėvo chromosomos sritį - ir atvirkščiai.

Superlaidumas
Mikrobiotechnologija
Metalinis vandenilis
Robertas Kochas ir Lietuva
3-iojo tūkstantmečio mokslas
Nanomedicina nusitaiko į vėžį
Vilniaus Universiteto chemikai
Kodėl chemikai nemėgsta J ir Q
Celuloidas – plastmasių prosenelis
Kelionė po cheminių elementų lentelę
Kvantinė chemija – ateities mokslas?
Atvertas kelias į amžinos jaunystės fontaną
Šiuolaikinė fizika – į tiesą panašus mitas?
Chemikai: Nobelio premijos laureatai
Amžinas judėjimas laiko kristaluose
Elektra, kol dar nebuvo vartotojų
Žarnyno bakterijų perspektyva
Siurbkite tiesiai į smegenis
Šaltoji branduolių sintezė
Mažosios saulės mįslės
Manipuliacijos šviesa
Atominio amžiaus vaikai
Kai reikia laisvinamųjų
Stomatologijos istorija
Vartiklis